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Calcular la actividad anticomplementaria (AAC)
de la sustancia a examinar empleando como refe-
rencia el complemento control considerado como
100 %, a partir de la fórmula siguiente:
100(
a-b
)/
a
en la cual
a
es la media de la actividad del com-
plemento (CH
50
/ml) del complemento control y
b
es la actividad del complemento (CH
50
/ml) de la
sustancia a examinar.
El ensayo no es válido a menos que:
!
i-
dades anticomplementarias encontradas para los
controles AAC negativos y los controles AAC
positivos se sitúen en los límites indicados en el
prospecto que acompaña la preparación de refe-
rencia; la actividad del complemento control (
a
)
esté comprendida entre 80 y 120 CH
50
por milili-
tro.
$
'
%
El activador de precalicreína (PCA) transfor-
ma la precalicreína en calicreína y ésta puede
valorarse por su capacidad de escindir un cromó-
foro a partir de un sustrato peptídico sintético. El
grado de clivaje se puede medir por espectrofoto-
metría y la concentración de PCA se calcula por
comparación con una preparación patrón calibrada
en Unidades Internacionales. La Unidad Interna-
cional corresponde a la actividad de una determi-
nada cantidad del Patrón Internacional, que está
constituido por activador de la precalicreína liofi-
lizado. La equivalencia en Unidades Internacio-
nales de la muestra patrón internacional la esta-
blece la Organización Mundial de la Salud.
.
Solución reguladora A -
Disolver 6,055 g de
tris(hidroximetil)aminometano, 1,17 g de cloruro
de sodio, 50 mg de bromuro de hexadimetrina y
100 mg de azida de sodio en agua. Ajustar a
pH 8,0 con ácido clorhídrico 2 M y diluir hasta
1 litro con agua.
Solución reguladora B -
Disolver 6,055 g de
tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro
de sodio en agua. Ajustar a pH 8,0 con ácido
clorhídrico 2 M y diluir hasta 1 litro con agua
.
Preparación del sustrato de la precalicreína -
NOTA: para evitar que se active la coagulación,
la sangre o el plasma utilizados para la prepara-
ción de la precalicreína deben ponerse en contacto
sólo con material plástico o de vidrio tratado con
silicona. Añadir 9 volúmenes de sangre humana
sobre un volumen de una solución de anticoagu-
lante (ACD, CPD o una solución de citrato de
sodio 38 g por litro) a la que se le ha agregado
1 mg por mililitro de bromuro de hexadimetrina.
Centrifugar la mezcla a 3.600
g
durante
5 minutos. Separar el plasma y centrifugar de
nuevo a 6.000
g
durante 20 minutos para que
sedimenten las plaquetas. Separar el plasma po-
bre en plaquetas y dializar frente a 10 volúmenes
de
Solución reguladora A
durante 20 horas. Des-
pués de la diálisis, aplicar el plasma sobre una
columna de cromatografía que contiene agarosa-
DEAE para cromatografía de intercambio iónico,
que haya sido equilibrada con
Solución regulado-
ra A
y cuyo volumen sea igual a dos veces el
volumen del plasma. Eluir con
Solución regula-
dora A
a un flujo de 20 ml/cm
2
/h. Recolectar el
eluido en fracciones y medir la absorbancia a
280 nm. Reunir las fracciones que contengan el
primer pico de proteínas para obtener aproxima-
damente un volumen de 1,2 veces el volumen del
plasma pobre en plaquetas.
Para verificar que el sustrato está exento de ac-
tividad de calicreína, mezclar 1 volumen del mis-
mo con 20 volúmenes de solución del sustrato
cromogénico que será utilizado durante el ensayo
precalentada e incubar a 37 °C durante 2 minutos.
El sustrato es adecuado si la absorbancia no au-
menta más de 0,001 por minuto. Agregar a la
solución de sustrato 7 g por litro de cloruro de
sodio y filtrar utilizando un filtro de membrana de
0,45 µm. Congelar el filtrado en alícuotas y con-
servar a –25 °C; el sustrato también puede liofili-
zarse para su conservación. NOTA: efectuar
todas las operaciones, desde el inicio de la croma-
tografía hasta la congelación en partes alícuotas,
durante una misma jornada de trabajo.
$
Es preferible realizar la valoración utilizando
un analizador enzimático automatizado a 37 °C,
con volúmenes, concentraciones de sustrato y
tiempos de incubación ajustados para que la velo-
cidad de reacción sea lineal al menos hasta
35 UI/ml. Los patrones, las muestras y el sustrato
de la precalicreína pueden diluirse, si fuese nece-
sario, con
Solución reguladora B.
Incubar los patrones o las muestras diluidos
durante 10 minutos con sustrato de precalicreína,
de forma que el volumen del patrón o de la mues-
tra sin diluir no sobrepase 1/10 del volumen total
de la mezcla de incubación, para evitar errores
producidos por la variación de la fuerza iónica y
el pH. Incubar la mezcla o una parte de ella con
un volumen igual de una solución de un sustrato
cromogénico sintético que sea específico para la
calicreína (por ejemplo, acetato de
N
-benzoil-
L
-
prolil-
L
-fenilalanil-
L
-arginina 4-nitroanilida o
dihidrocloruro de
D
-prolil-
L
-fenilalanil-
L
-arginina
4-nitroanilida), disuelto en
Solución reguladora B
.