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na requerida
Solución reguladora barbital - gelatina
Hemolisina
Volumen (ml)
Dilución (1:….)
Volumen (ml)
7,5
0,65
no diluido
0,1
10
0,90
no diluido
0,1
75
1,80
7,5
0,2
100
1,80
10
0,2
150
1,00
75
1,0
200
1,00
100
1,0
300
1,00
150
1,0
400
1,00
200
1,0
600
1,00
300
1,0
800
1,00
400
1,0
1.200
1,00
600
1,0
1.600
1,00
800
1,0
2.400
1,00
1.200
1,0
3.200*
1,00
1.600
1,0
4.800*
1,00
2.400
1,0
* Descartar 1,0 ml de la mezcla.
Agregar 1,0 ml de
Suspensión patrón de eritro-
citos de carnero al 5 %
a cada tubo de la serie de
Diluciones de hemolisina
, comenzando con la dilu-
ción 1:75 y mezclar. Incubar a 37 °C durante
30 minutos.
Transferir 0,2 ml de cada mezcla de
Dilución de
hemolisina
a tubos nuevos y agregar 1,10 ml de
Solución reguladora gelatina-barbital
y 0,2 ml de
una dilución de
Complemento de cobayo
(por ejem-
plo 1:150). Realizar estas operaciones por duplica-
do.
Como control de células sin hemólisis preparar
tres tubos con 1,4 ml de
Solución reguladora gela-
tina-barbital
y 0,1 ml de
Suspensión de eritrocitos
de carnero al 5 %
.
Como control de células hemolisadas preparar
tres tubos con 1,4 ml de agua y 0,1 ml de
Suspen-
sión de eritrocitos de carnero al 5 %
.
Incubar todos estos tubos a 37 °C durante
60 minutos y centrifugar a 1.000
g
durante
5 minutos. Medir la absorbancia de cada líquido
sobrenadante a 541 nm y calcular el grado de hemó-
lisis de cada tubo por la fórmula siguiente:
(
A
a
–
A
1
) / (
A
b
–
A
1
)
en la cual
A
a
es la absorbancia de los tubos que
contienen las
Diluciones de hemolisina
,
A
b
es la
absorbancia media de los tres tubos con hemólisis
total y
A
1
es la absorbancia media de los tres tubos
sin hemólisis.
Graficar el grado de hemólisis obtenido, en por-
centaje, en función de la inversa de la
Dilución de
hemolisina.
Determinar la dilución óptima de
hemolisina a partir del gráfico. Elegir una dilución
en la que un aumento de la cantidad de hemolisina
ya no produzca una variación sensible del grado de
hemólisis. Esta dilución se considera que contiene
1 unidad mínima de hemólisis (1 UMH) en 1,0 ml.
La dilución óptima hemolítica de hemolisina para la
preparación de eritrocitos de carnero sensibilizados
contiene 2 UMH por ml.
La titulación de hemolisina no es válida si la
hemólisis máxima no esta comprendida entre el 50
y el 70 %. Sí el máximo grado de hemólisis no está
en este intervalo, repetir la titulación utilizando una
disolución de complemento más o menos diluida
según corresponda.
Preparación de eritrocitos de carnero sensibili-
zados (sistema hemolítico)
Preparar una cantidad adecuada de hemolisina
diluida conteniendo 2 UHM por ml y un volumen
igual de
Suspensión patrón de eritrocitos de carne-
ro al 5 %
. Añadir la dilución de hemolisina a la
suspensión patrón de células y mezclar. Incubar a
37 °C durante 15 minutos; conservar entre 2 y 8 °C
y emplear dentro de las 6 horas de preparada.
Titulación del complemento
Preparar una dilución apropiada de complemen-
to (por ejemplo 1:250) con
Solución reguladora
gelatina-barbital
y realizar la titulación por dupli-
cado según se indica en la siguiente tabla:
Tubo
N°
Volumen de complemento diluido (ml)
(por ej. 1:250)
Volumen de Solución reguladora de
gelatina-barbital (ml)
1
0,1
1,2