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factor de von Willebrand a las fibras de colágeno y
la posterior unión a un anticuerpo policlonal anti-
factor de von Willebrand conjugado a una enzima,
la cual, al agregar un sustrato cromogénico, genera
un producto que puede ser cuantificado espectrofo-
tométricamente. Bajo condiciones apropiadas exis-
te una relación lineal entre el factor de von Wille-
brand unido a colágeno y la absorbancia.
.
Colágeno
- Emplear fibras de colágeno humano
o equino nativas tipo I o III. Pueden emplearse
soluciones de colágeno.
Diluyente de Colágeno
- Disolver 50 g de glu-
cosa en agua, ajustar a pH entre 2,7 y 2,9 con ácido
clorhídrico 1 M y diluir a 1 litro con agua.
Solución reguladora salina fosfatada (PBS)
-
Disolver 8 g de cloruro de sodio, 1,05 g de fosfato
dibásico de sodio, 0,2 g de fosfato monobásico de
sodio y 0,2 g de cloruro de potasio en agua. Ajustar
a pH 7,2 con hidróxido de sodio 1 M o ácido
clorhídrico 1 M y diluir a 1 litro con agua.
Solución reguladora de lavado
-
Solución regu-
ladora salina fosfatada
conteniendo 1 g por litro de
polisorbato 20.
Reactivo bloqueante
-
Solución reguladora sa-
lina fosfatada
conteniendo 1 g por litro de polisor-
bato 20 y 10 g por litro de albúmina sérica bovina.
Solución reguladora de dilución
-
Solución re-
guladora salina fosfatada
conteniendo 1 g por litro
de polisorbato 20 y 50 g por litro de albúmina sérica
bovina.
Conjugado
- Suero de conejo anti-factor de von
Willebrand humano conjugado con peroxidasa.
Emplear de acuerdo a las instrucciones del fabrican-
te.
Solución sustrato
- Inmediatamente antes de
emplear disolver una tableta de dicloruro de o-
fenilendiamina y una tableta de peróxido de hidró-
geno en 20 ml de agua o un volumen adecuado de
peróxido de hidrógeno. [NOTA: proteger de la
luz.]
Placas de microtitulación
- Placas de poliesti-
reno de fondo plano con superficies optimizadas
para enzimoinmunoensayo y alta capacidad de
unión a proteínas.
Preparación estándar
- Reconstituir la prepara-
ción de referencia según se indica en el rótulo.
Diluir con
Solución reguladora de dilución
para
obtener una solución de aproximadamente 1 UI de
factor de von Willebrand. Preparar dos series inde-
pendientes de no menos de tres diluciones cada una
con
Solución reguladora de dilución
.
Preparación muestra
- Reconstituir la prepara-
ción en ensayo según se indica en el rótulo. Diluir
con
Solución reguladora de dilución
para obtener
una solución de aproximadamente 1 UI de factor de
von Willebrand. Preparar dos series independientes
de no menos de tres diluciones cada una con
Solu-
ción reguladora de dilución
.
Procedimiento
- Llevar la solución de
Colágeno
a temperatura ambiente. Diluir con
Diluyente de
colágeno
para obtener una solución entre 30 y
75
ágeno, mezclar para obtener una
suspensión uniforme de fibras de colágeno. Colo-
car 100
ón.
Cubrir la placa con un film plástico e incubar a
37 ºC durante toda la noche. Vaciar los orificios de
la placa cubierta con colágeno invirtiéndola y dejar
secar sobre papel absorbente. Agregar 250
Solución de lavado
. Vaciar los orificios de la placa
invirtiéndola y dejar secar sobre papel absorbente.
Repetir la operación tres veces. Agregar 250
Reactivo bloqueante
a cada orificio, cubrir la placa
con un film plástico e incubar a 37 ºC por una hora.
Vaciar los orificios de la placa invirtiéndola y dejar
secar sobre papel absorbente. Agregar 250
Solución de lavado
. Vaciar los orificios de la placa
invirtiéndola y dejar secar sobre papel absorbente.
Repetir la operación tres veces. Agregar 100
Preparación muestra
o de
Preparación estándar
en
los orificios. Agregar 100
Solución regulado-
ra de dilución
a una serie de orificios que actúan
como control negativo. Cubrir la placa con un film
plástico e incubar a 37 ºC por dos horas. Vaciar los
orificios de la placa invirtiéndola y dejando secar
sobre papel absorbente. Agregar 250
Solu-
ción de lavado
. Vaciar los orificios de la placa
invirtiéndola y dejar secar sobre papel absorbente.
Repetir la operación tres veces. Preparar una dilu-
ción apropiada del conjugado con
Solución regula-
dora salina fosfatada
conteniendo albúmina sérica
bovina 5 g por litro y agregar 100
Cubrir la placa con un film plástico e incubar a
37 ºC durante dos horas. Vaciar los orificios de la
placa invirtiéndola y dejar secar sobre papel absor-
bente. Agregar 250
Solución de lavado
. Va-
ciar los orificios de la placa invirtiéndola y dejar
secar sobre papel absorbente. Repetir la operación
tres veces. Agregar 100
Solución sustrato
a
cada orificio e incubar a temperatura ambiente
durante 20 minutos en la oscuridad. Agregar 100
de ácido clorhídrico a cada orificio. Medir las ab-
sorbancias a 492 nm. Emplear los valores de absor-
bancia para estimar la potencia de la preparación
con los métodos estadísticos habituales. El ensayo
solo es válido si los valores de absorbancia para los
controles negativos son mayores que 0,05.
.
2
Preparar diluciones apropiadas de la preparación
en ensayo y de la preparación de referencia emple-