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Estimar la potencia del Concentrado de Anti-
trombina III Humana por comparación de su habili-
dad para inactivar trombina en presencia de un
exceso de heparina con la misma habilidad de una
sustancia de referencia de antitrombina III humana
calibrada en UI. Mezclar cantidades variables de
antitrombina III con una cantidad dada de trombina
y determinar el remanente de trombina mediante
un sustrato cromogénico apropiado.
La Unidad Internacional es la actividad de anti-
trombina III de una cantidad establecida de Patrón
Internacional de antitrombina III. La equivalencia
en Unidades Internacionales del Patrón Internacio-
nal la establece la Organización Mundial de la Sa-
lud.
Aplicar la siguiente técnica.
Soluciones reguladoras
- Emplear Tris-EDTA
pH 8,4 y Tris-EDTA BSA pH 8,4 (ver
Soluciones
reguladoras
en
Reactivos y Soluciones
).
Solución reguladora para dilución
- Preparar
una solución de Tris-EDTA BSA pH 8,4 que con-
tenga 15 UI de heparina por ml.
Solución de trombina bovina
- Preparar una so-
lución que contenga 2 UI de trombina bovina por
ml de solución reguladora Tris-EDTA BSA pH 8,4.
Sustrato cromogénico
-
D
-fenilalanil-
L
-pipecolil-
L
-arginina-4-nitroanilida reconstituido
en agua para obtener una solución 4 mmol por litro.
Preparación estándar
- Diluir la sustancia de
referencia de antitrombina III humana calibrada en
UI con
Solución reguladora para dilución
para
obtener una solución que contenga una 1 UI de
antitrombina III por ml. Realizar por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres dilucio-
nes en el rango de 1/75 a 1/200 en progresión ge-
ométrica o aritmética utilizando la misma
Solución
reguladora
.
Preparación muestra
- Diluir El Concentrado
de Antitrombina III Humana con
Solución regula-
dora
para obtener una solución que contenga 1 UI
de antitrombina III por ml. Realizar por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres dilucio-
nes en el rango de 1/75 a 1/200 en progresión ge-
ométrica o aritmética utilizando la misma
Solución
reguladora
.
Procedimiento
- Según el ensayo se realice en
tubos o en microplacas, ajustar los volúmenes de
manera que se mantengan las proporciones de la
mezcla. Realizar dos reacciones de cada dilución.
Precalentar 200 µl de cada dilución de la
Prepara-
ción muestra
y de la
Preparación estándar
a 37 °C
durante 1 a 2 minutos. Agregar a cada dilución
200 µl de
Solución de trombina bovina
, mezclar y
mantener a 37 °C durante 1 minuto. Agregar 500 µl
de
Sustrato cromogénico
diluido hasta una concen-
tración apropiada para el ensayo usando solución
reguladora Tris-EDTA BSA pH 8,4 (sin albúmina).
Medir inmediatamente el cambio de las absorban-
cias a 405 nm durante al menos 30 segundos. Cal-
cular el valor de
A/min. Alternativamente puede
llevarse a cabo un ensayo de punto final deteniendo
la reacción con ácido acético y midiendo la absor-
bancia a 405 nm o también es posible detener la
reacción de hidrólisis tras un intervalo apropiado
bajando el pH mediante el agregado de un reactivo
apropiado, como ácido acético al 50 %v/v o una
solución de citrato 1 M a pH 3. El valor de cambio
de absorbancia (
A/min) o A es inversamente pro-
porcional a la actividad de antitrombina III. Calcu-
lar la potencia de la muestra a examinar y compro-
bar la validez del ensayo empleando los métodos
estadísticos habituales (ver
10. Análisis estadístico
de resultados de ensayos biológicos
).
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El método para determinar la actividad de hepa-
rina en factores de coagulación es un ensayo cro-
mogénico en el cual se estima su actividad por su
efecto inhibitorio sobre el factor Xa (actividad anti-
Xa). La potencia de heparina se estima comparan-
do su actividad inhibitoria con un Patrón Interna-
cional o Patrón Nacional calibrado en Unidades
Internacionales.
La Unidad Internacional es la actividad de hepa-
rina en una cantidad establecida de patrón Interna-
cional. La equivalencia en Unidades Internaciona-
les del Patrón Internacional la establece la Organi-
zación Mundial de la Salud.
El método cromogénico de valoración consiste
en los siguientes pasos: la formación del complejo
heparina-antitrombina III, en el cual se debe asegu-
rar un exceso de antitrombina III en el medio en el
que se produce la reacción, la formación del com-
plejo heparina antitrombina III-factor Xa, en el cual
el factor Xa debe estar en exceso, y el clivaje en-
zimático de un sustrato cromogénico específico
para factor Xa (residual) para dar un cromóforo que
puede ser cuantificado espectrofotométricamente.
Bajo condiciones adecuadas, existe una relación